羧基硝酸盐大肠杆菌因子作用结构(硝酸盐羧基大肠杆菌因子结构)

前言：硝酸盐（nitrate），是一种含有氮和氧的化合物，NarL进行的生化和晶体学研究表明，羧基末端结构域（CTD）的二聚化和DNA结合受到未磷酸化的氨基末端接收器结构域的抑制
NarL-CTD和NarP-CTD从其接收器结构域中解放出来，从II类napF和yeaR操纵子控制区激活体内转录，NarL 和 NarP 是副同源反应调节因子，可控制厌氧基因表达以响应有利的电子受体硝酸盐和亚硝酸盐
应变结构突变等位基因可以通过噬菌体P1介导的广义转导在菌株之间进行转移，对于某些菌株，可以通过选择相邻的att80整合等位基因来实现TRP+标记的转移
在转移过程中，使用标准方法进行限制性核酸内切酶消化、连接、转化和PCR扩增，采用QuikChange协议（Stratagene Cloning Systems）可以实现寡核苷酸定向的位点特异性诱变
纳尔·†和 narP†等位基因narL基因是自调控的，而narP基因不是，为了确保表达水平的等效性，将narP上游的转录调控区和Shine-Dalgarno序列与narL起始密码子融合
这个过程通过引入NdeI限制性核酸内切酶位点，使narL（CCC ATG改为CAT ATG）和NAP（ACT ATG改为CAT ATG）的起始密码子与NdeI重叠，将经NdeI修饰的narL基因亚克隆到narP质粒中下游的BamHI位点，以替换相应的narP序列
这些经过NdeI修饰的等位基因被设计为含有两个额外的限制性核酸内切酶位点，MIV位点位于接收器区域编码区，XhoI位点位于CTD编码区（螺旋α7；narL密码子164-165，CTC AAG改为CTC GAG；narP密码子162-163，CTG CAC改为CTC GAG）
这些位点引起了错义替换（NarL中的Lys-165变为Glu；NarP中的Lys-125变为Gly和His-163变为Glu），旨在进行单独的研究以分析NarL-NarP复合物的特性，经过对照实验证实，这些错义替换不影响调控表型
修饰的基因被表示为narL†和narP†以将它们与野生型区分开，narL†和narP†基因被重新克隆到下游的BamHI位点，与narP起始密码子上游490 nt的EcoRI位点重组，并插入中等拷贝数质粒pSU19中，插入片段与载体lacZ启动子的方向相反
narL-CTD和narP-CTD等位基因SphI位点被插入到域间接头编码区（narL密码子147-148，GCC ACT改为GCA TGC；narP密码子146-147，GCG GAA改为GCA TGC），将该片段（SphI-Hin dIII）克隆到质粒LITMUS 39中，随后再重新克隆（Sal I-HindIII）到质粒pSU18中
所得到的质粒被设计用于表达NarL-CTD和NarP-CTD，其中载体的氨基末端延伸了20个残基（MTMITNSSSVPGDPLESTAC），对应于LacZ的氨基末端和多接头区域
培养基和条件 复杂且指示性的培养基进行遗传操作，同时，前面提到使用MOPS缓冲用于酶测定来确定培养基的配制，在指数中期停滞的过夜培养基中含有葡萄糖（6 mM）或葡萄糖加NaNO3的培养基3（分别为4和10 mM）
携带质粒的菌株在胰蛋白胨酵母提取物葡萄糖（TYEG）培养基中进行培养，该培养基含有0.8%胰蛋白胨、0.5%酵母提取物、0.5%NaCl、Vogel-Bonner磷酸盐缓冲盐，添加了纳诺3（40 mM）
培养物在37°C下进行指数中期生长，大约达到35-40 Klett单位，使用配备了66号（红色）滤光片的Klett-Summerson光电色度计（Klett Manufacturing）来监测培养密度，正如前面提到的，厌氧培养物在螺旋盖管中进行生长
LacZ测定β-半乳糖苷酶活性测定，所有培养物一式两份，报告值来自至少两个独立实验，相对激活或抑制作为相应野生型值的百分比计算
将在域间接头编码区域内引入的SphI位点的narL或narP序列克隆到质粒pQE30中，构建了表达构建体，氨基终点序列为MRGSH6GSACTERD...表示其为6-NarL-CTD，而氨基终点序列为MRGSH6GSACEDPF...表示其为6-NarP-CTD（NarL和NarP序列以斜体表示）
这个6-NarL-CTD蛋白与用于NarL-DNA相互作用的X射线分析的蛋白几乎完全相同，后者的氨基末端为MRGSH6GS
电泳迁移率移位测定 （EMSA）质粒pVJS3253构建体被用作模板制备，其中，lac操纵子的主要操作员O1-lac被Nar结合位点所取代，引物AVL2478和AVL2479（分别为5′-GACGCCCCATAAACTGCCAGGAATTG-3′和5′-CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGACG-3′）在O1-lac的上游和下游进行退火，产生332 bp的产物
这些片段在经过Eco RI消化后生成296 bp的片段，Eco RI切割位点靠近lacI基因的末端，O1-lac的取代物位于所得片段的中间，片段的末端通过使用DNA聚合酶I大片段和[α-32P]dATP（Perkin Elmer）进行标记
将蛋白质与2 nM的32P标记的DNA一起孵育，在室温下，在含有10 mM Tris（pH 10.7）、5 mM KCl、50 mM EDTA、1 mM DTT、1 mM MgCl2的反应缓冲液中孵育5分钟，反应缓冲液中还加入了15 mg/mL聚-dIdC和10%甘油（V/V）
添加100 mM的乙酰磷酸酯以磷酸化6-NarL和6-NarP，对照实验确定了乙酰磷酸酯浓度不影响电泳迁移减缓（EMSA），将反应混合物立即加载到以6V运行的100%非变性聚丙烯酰胺凝胶上，并在1°C下进行4小时的电泳，放射性标记的带子使用带有ImageQuant软件的Storm PhosphorImager扫描仪进行分析
NarL 和 NarP DNA 结合使用EMSA确定了NarL-CTD对体外几个7-2-7靶位点的亲和力，选择了其中三个位点来测量NarP-CTD的亲和力，也是通过使用EMSA
靶序列是来自nirB和napF操纵子的天然位点，以及由两个倒置的nirB七聚体-74拷贝组成的人工位点，我们的nirB（-74/−74）位点（中央AT）版本与之前使用的（中央TA）略有不同
K型D用于NarL-CTD与nirB位点的结合，与之前报道的相似：0.45μM，相反，我们测量的K要高得多，DnirB（-74/−74）和napF位点的值，分别报告为0.65和0.45μM，lac O1取代构建体的NarL依赖性抑制对于nirB位点比nirB（-74 / -74）和napF位点强得多，因此体外和体内的相对亲和力广泛相关
通过对乙酰磷酸盐孵育磷酸化的全长NarL进行实验，我们观察到其与NarL-CTD测量到的亲和力相似，进一步扩展了对narG（-89/−89）位点的观察，相比之下，即使在与高浓度乙酰磷酸盐孵育后，全长NarP的结合能力仍然非常弱
我们推测乙酰磷酸盐可能是NarP自磷酸化相对较差的底物，NarP-CTD与所有三个位点均表现出强结合，这证实了NarP接收器抑制结合的现象，类似于NarL，并且NarP-CTD在体外与NarL-CTD一样具有高度的靶位点结合能力
NarL-CTD-DNA的X射线结构显示出与主要凹槽碱基对直接接触的识别螺旋残基Lys-188、Val-189和Lys-192，我们在这些位置上进行了每个位置的Ala替换，并测量了NarL-CTD对DNA的体外亲和力以及O1-lac取代构建体对NarL的抑制影响
K192C替换消除了体外结合，NarP R190A突变体在体外也得到了类似的结果，尽管TraR R210A突变体在体内和体外都表现出与野生型相似的结合能力，降低了15-20%
NarL K188A和NarP K186A的替代物在体外的结合仅减少了两到三倍，NarL残基Lys-188与DNA的5、6和7位置接触，而这些位置在NarL七聚体序列中不太保守，因此可能对整体的亲和力不是很重要
NarL K188A突变体在体内显示出非常弱的抑制效果，这暗示其他因素（如超螺旋）可能影响结合位点的识别，相比之下，TraR R206A突变体在两种测定中均显示无法检测到的结合能力
NarL-CTD和NarP-CTD转录对照Nar依赖性控制区域是复杂多样的，监测了来自中等拷贝数质粒的表达全长或CTD版本的NarL和NarP的narL narP双零菌株中靶操纵子表达，NarL-CTD和NarP-CTD蛋白激活了Φ转录的程度与全长对应物相同
同样，NarP和NarP-CTD是来自野生型Φ，它没有被NarL激活，CTD蛋白在刺激Φ（yeaR-lacZ）表达方面的有效性约为全长对应物的20-25%，CTD蛋白能够激活NarII类对照区的转录
相比之下，CTD蛋白是来自lac O1取代构建体O1-napF的转录的非常弱的抑制因子，O1-nirB和O1-nrfA，即使CTD蛋白在体外很好地结合这些位点，CTD蛋白都没有激活Φ（narG-lacZ）或Φ（fdnG-lacZ）表达，这些结果表明，接收器域对于体内的这些过程很重要
NarL 阳性对照 （PC） 突变体通过鉴定PC（Protein Contact）错义替代等位基因，确定了特定侧链决定因素在转录激活中的作用，这些等位基因产物在DNA结合方面接近正常水平，但在转录激活方面存在缺陷
识别NarL的PC替代，我们使用位点特异性诱变将九种不同表面突出的残基替换为丙氨酸（Ala），从而得到多个突变体，我们特别关注那些已被确认为赋予TraR PC表型的突变体，在不同的突变体中，第十个突变体D180A的结果存在相互矛盾，因此被排除在外
另外四个突变体（D162A，M175A，Q169A和L166A）中的每个突变体类别中，至少有一个报告基因显示出70%或更多的野生型激活值，而另外三个突变体（R178A，R179A和D181A），被标记为PC，表现出60%或更少的野生型激活值，然而，对于两个II类报告基因，它们都具有85%或更多的野生型激活值
为了进一步研究这些突变体，我们进行了双重替代实验，R178A + D181A突变体的结果在不同的测定中出现了矛盾，因此被排除在外，另外两个双重突变体显示出强大的抑制作用，但所有报告基因的转录激活都存在缺陷
R178A突变体显示出最强的PC表型，为了进一步验证这一突变体，我们对Fnr非依赖性的II类报告基因Φ（yeaR-lacZ）进行了测试，结果显示，R178A突变体在转录激活方面表现出明显的缺陷（29%），而R179A突变体接近正常水平（79%），R178A突变体的II类PC表型明显被napF对照区与Fnr的协同作用所掩盖
结论:研究发现大多数 Nar 调节操纵子的转录由 Fnr 激活，NarL 和 NarP 在 Fnr 依赖性厌氧诱导之上施加硝酸盐响应控制，分别与RNA聚合酶亚基α-CTD以及α和σ相互作用，介导了lacO1取代结构的低效抑制，可以进行转录激活所必需的蛋白质 - 蛋白质接触
参考文献：【1】Aravind，《螺旋-转-螺旋结构域的许多方面：转录调控及其他》【2】Barnard，《大肠杆菌反应调节因子NarL的结构》【3】Browning，《细菌转录起始的秘密由大肠杆菌FNR蛋白教授
在信号，开关，调节器和级联》【4】 Greenberg，《 蛋白的 C 末端区域包含一个诱导子非依赖性 lux 基因激活结构域》