简介小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)原代培养可应用于：（1）细胞保种；（2）分子生物学研究；（3）基因治疗相关研究操作方法胰酶消化法1原理将小鼠的胚胎成纤维细胞（MEF）从机体中取出，经胰酶、螯合剂（常用EDTA）处理，分散成单细胞，置MEF生长培养基中培养，使细胞得以生存、生长和繁殖材料与仪器孕鼠PBS EDTA胰酶MEF生长培养基FBS高糖DMEM眼科直剪眼科直镊眼科弯镊玻璃平皿3尼龙滤网离心管手术刀片步骤一、实验材料准备1.动物孕期14至16天的孕鼠(小鼠)2.试剂无Ca2+和Mg2+的PBS(D-PBS)、0.05%胰酶、0.53 mmol/L EDTA溶液、MEF生长培养基(高糖DMEM加10%FBS)3.器械眼科直剪3把、眼科直镊3把、眼科弯镊2把、玻璃平皿3套、200目尼龙滤网、50 ml和15 ml离心管和手术刀片以上物品均需要高压灭菌消毒处理二、具体操作1.处死孕鼠，全身置于75%酒精里浸泡，然后在超净台中用剪刀和镊子将孕鼠皮肤剪开，用另外一组剪刀、镊子剪开腹部肌层，露出子宫，最后用第三组剪刀和镊子将子宫小心取出放在盛有D-PBS的玻璃平皿中，冲洗去血2.用两把弯镊子将胚胎外的胞膜小心去除，然后夹掉头和内脏，将其余胚胎转移到一个装有30 ml D-PBS的50 ml离心管中，轻轻颠倒两次，倒掉D-PBS，再重复此步骤一次，注意要留少许D-PBS，然后将胚胎转移到另一装有D-PBS的平皿中，并用手术刀片将其细细切碎3.用200 ul的移液枪反复、快速地吹打平皿中的液体，转移至15 ml离心管中，于4℃1500 rpm离心5分钟，倒掉上清，以10 ml胰酶重悬沉淀，放在37℃水浴中消化30分钟，且每隔五分钟轻轻晃动，使之充分消化4.将上层细胞悬液倒入一个装有10 ml MEF生长培养基的50 ml离心管中，用200目的尼龙网过滤后，以1 500 rpm离心5分钟收集细胞，再用30 ml MEF生长培养基洗涤两次5.细胞沉淀用15 ml MEF生长培养基重悬后进行细胞计数(一般8只14天的胎鼠可获得2-3x107细胞)6.3x106细胞悬浮于15 ml MEF生长培养基中，接种到200 ml培养瓶中7.24小时后更换新鲜的MEF生长培养基8.细胞长满后，先用D-PBS冲洗，倒掉后加胰酶消化(此步时间不宜过长，作者一般不超过五分钟)，按1:5传代9.细胞再次长到覆盖率80-90%左右，将其消化后，常规冻存(冻存液要现配)小鼠胚胎成纤维细胞(MEF 100倍)注意事项1.原代培养，一定要避免污染2.MEF生存能力有限，如果不冻存，体外存活十代左右3.冻存后复苏的细胞只能传代一次，因为这些细胞繁殖能力有限4.消化细胞时间不要过长胰酶消化法2原理将小鼠的成纤维细胞（MEF）从机体中取出，经胰酶、螯合剂（常用EDTA）处理，分散成单细胞，置MEF生长培养基培养基中培养，使细胞得以生存、生长和繁殖材料与仪器小鼠PBS胰酶液氮镊子平皿剪刀刮胡刀片离心管培养箱离心机移液枪显微镜步骤一、取得小鼠胚胎1.性成熟母小鼠与种公鼠按1公（♂）:2母（♀）比例合笼2.每天早上观察母小鼠阴道口有乳白色或蛋黄色冻胶状物(阴道栓)即确定为怀孕见栓当天上午定为怀孕的0.5d3.取怀孕12.5～14.5 d母鼠，断颈处死，无菌条件下暴露子宫4.用镊子提起近子宫颈端，分离子宫系膜，剪断子宫角5.取出整个子宫，置于有PBS的平皿内用PBS洗涤三次，弃除表面残余血迹6.沿子宫系膜侧剪开子宫，取出带有胎膜的胚胎，置于另一盛有PBS的平皿内，充分洗涤，弃除表面红细胞7.用小镊子撕破胎膜，取出胎鼠，弃除胎膜，用PBS洗涤三次8.去除胚胎头部、内脏和四肢，将躯干部置于另一盛有PBS的平皿内，用PBS至少洗涤三次，充分弃除红细胞二、取得小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）1.用无菌眼科小剪刀或刮胡刀片将鼠胚躯干剪(切)成1mm3以下的碎块，吸置于离心管内2.加适量胰酶，将离心管置于培养箱中10-20分钟3.取出离心管，反复吹打，加足量培养液终止消化4.离心1000转，5分钟5.弃掉上清，加适量培养液，反复吹打20次6.分装到T75中，一般每2个胚胎可以制成一个T75的原代细胞7.置37℃、5%CO2、饱和湿度培养箱培养8.待细胞长3-7天细胞互相重叠爬满整个培养瓶底时即可1：3-1：6传代9.吸弃培养液上清10.PBS（不含钙镁）冲洗两次11.加0.25%胰酶-0.02EDT消化12.在显微镜下观察，当少量细胞漂浮，贴壁的细胞层出现裂隙时，用移液管吹打冲洗瓶底5-6次13.即刻加MEF培养液终止消化14.1000转，5分钟离心吸弃上清15.加足培养液，吹打制成单细胞悬液，分装到各T75中完成传代16.原代细胞中还有少量组织块未被充分消化，在以后的每次传代过程中要尽量制成单细胞悬液，组织块会逐渐消失17.原代细胞中混有一些杂细胞，一般传到第3代时，杂细胞逐渐减少小鼠胚胎成纤维细胞为梭状；但连成片时，细胞互相交联，形态不典型三、MEF的冻存1.当细胞90%-100%融合时，尤其细胞少量堆聚可冷冻2.处理方法同二的9-14，每75 cm2的细胞加3 ml冻存液重悬细胞3.每个冻存管编号加1 ml细胞悬液4.置入程序降温盒-80℃过夜，放入液氮长期保存四、灭活MEF制备饲养层细胞1.取新的培养瓶，加0.1%Gelatin溶液覆盖预处理30分钟，用前吸掉Gelatin溶液2.取需要处理的MEF细胞，以10ug/ml浓度加丝裂霉素（Mitomycin C）混匀3.置培养箱中3小时4.吸弃废液5.用DPBS洗5遍6.处理方法同二11-147.处理过的MEF加适量培养液重悬计数，以3.0x104/cm2（MEF）铺在Gelatin处理过的培养瓶上8.置培养箱中静置过夜，使其贴壁9.铺好的饲养层在1-7天内有效，都可以支持mES生长并维持其全能性
