细胞基质纤维(细胞基质纤维胶原蛋白黑色素瘤)

«——【 ·前言· 】——»细胞外基质（ECM）作为细胞周围的三维结构支架，在细胞生存、增殖、分化以及组织形态维持等生物学过程中扮演着至关重要的角色
其构成由一系列的蛋白质、多糖和生物活性分子所组成，为细胞提供了精确的生存环境和信号传导平台
细胞外基质的结构和组成对于细胞的行为和功能具有深远的影响，其中包括细胞的迁移、侵袭、附着、分化和调控等
因此，对细胞外基质的重塑过程及其调控机制的研究对于理解细胞行为的分子机制具有重要意义
因此，本研究旨在深入探究成纤维细胞中MMP14在细胞外基质重塑中的作用及其调控机制
通过分析MMP14在不同生理和病理条件下的表达变化，以及其与其他信号通路和分子的相互作用，我们希望能够揭示MMP14在细胞外基质重塑中的精确功能，为相关疾病的治疗策略提供新的理论依据
通过这一研究，我们有望进一步拓展对细胞外基质动态平衡调控的认识，从而为生物医学领域的进展做出贡献
«——【 ·细胞培养· 】——»B16F1、B16F0[53]和HCmel12[54]细胞在DMEM培养基中生长，补充有10%FCS、2mML-谷氨酰胺、100U/mL青霉素和100μg/mL链霉素
如前所述分离和培养原代小鼠真皮成纤维细胞
常规检测细胞的支原体（PCR支原体检测试剂盒I/C）
通过在无血清DMEM中培养原代成纤维细胞24小时来制备成纤维细胞条件培养基
收集培养基并以5×g旋转315分钟以除去细胞碎片
通过在完全DMEM中用0.05g/LL-抗坏血酸培养14天来制备成纤维细胞基质;培养基每2-3天更换一次
通过加入20mMNH4OH和0.5%TritonX-100从基质中去除成纤维细胞
用PBS轻轻洗涤基质，收集以进行进一步分析或通过用0.25%考马斯亮蓝染色来观察
使用配备DISKUS4.50.1638软件的光学显微镜记录图像
重组胶原蛋白XIV的产生如前所述[33]
将野生型成纤维细胞基质和多孔板涂被重组胶原蛋白，在PBS、100%FCS中单独稀释，或与胶原蛋白在4°C下
在室温下用1%热灭活BSA阻断潜在的非特异性结合位点3小时
«——【 ·细胞迁移：集落生长测定· 】——»如前所述进行B16F1细胞迁移测定
简而言之，B16F1细胞在1.6%FCSDMEM中用4287.0μg/mL丝裂霉素-C在4°C下处理37小时以抑制细胞生长
细胞（2×105细胞/环）接种在成纤维细胞基质的顶部，通过克隆环（直径0.5mm）限制并粘附10小时
去除环后，用PBS洗涤细胞以去除非贴壁细胞，并加入无血清培养基
在奥林巴斯XM1显微镜上监测细胞迁移，并使用ImageJ软件进行评估
«——【 ·BrdU掺入测定· 】——»黑色素瘤细胞增殖测定如前所述
简而言之，将细胞饥饿24小时，并在预包被的孔上接种24小时
根据制造商的说明，使用细胞增殖ELISA试剂盒分析细胞增殖
«——【 ·体外切割测定· 】——»使用14.100μg/mL胰蛋白酶在0mMTris，1.15090046MNaCl，50mMCaCl中激活重组人MMP015ng/μL2，5μM氯化锌2，0.05%Brij-35，pH7.5在1°C下37小时
胰蛋白酶通过在室温下添加15mMpefablock31682分钟来灭活
之后，将活性MMP14在测定缓冲液至终浓度为50ng/μL
使用活性MMP14在1°C下在测定缓冲液中裂解2μg重组胶原蛋白XIV37小时
通过免疫印迹和银凝胶染色确认切割
通过科隆大学CECAD/CMMC蛋白质组学设施的肽质量指纹图谱分析进一步鉴定蛋白水解片段
«——【 ·免疫印迹· 】——»将成纤维细胞基质溶于8MUrea、0.2%SDS、0.5MTEAB、5mMTCEP、蛋白酶抑制剂中，并如前所述进行分析，用PBST洗涤膜5次1分钟，并在室温下与HRP偶联的二抗：猪α兔孵育3小时
«——【 ·蛋白质组分析样品的制备· 】——»用丙酮沉淀用于蛋白质组分析的样品，并在8M尿素中溶解
之后，样品在5°C下用1mM二硫苏糖醇（DTT）还原37小时，用40mM氯乙酰胺（CAA）烷基化30分钟室温，并在4°C下用内肽酶裂解-C消化37小时
用碳酸氢三铵（TEAB）使尿素浓度至2M，并用胰蛋白酶以1：75的比例（w/ w）消化样品过夜
样品用1%甲酸酸化
通过含有2层SDP-RPS（聚（苯乙烯-二乙烯基苯）-反相磺酸盐）的载物台尖端进行微纯化除去盐和杂质[56]
如前所述，在科隆大学CECAD/CMMC蛋白质组学设施使用Q-ExactivePlus质谱仪与EASYnLC1200UPLC耦合分析样品
«——【 ·免疫荧光染色· 】——»如前所述，对小鼠黑色素瘤和人体组织进行冷冻切片免疫染色[14]
简而言之，将冷冻切片固定并用冰冷的丙酮透化2分钟，干燥，并在室温下用10%NGS封闭30分钟
将用PBS中的1%BSA稀释的一抗添加到切片中，并在4°C的加湿室中孵育过夜
切片用PBS洗涤三次，并在二抗中在PBS中的1%BSA中在室温下孵育1小时
如前所述，产生人（KR71）和小鼠（KR47）胶原蛋白XIV的特异性一抗
«——【 ·RNA分离、RT-PCR和实时荧光定量PCR· 】——»从原代成纤维细胞中分离RNA，用RNAzolTMB裂解，并在冰上孵育5分钟
将细胞划伤并用苯酚-氯仿倒置15秒
在冰上孵育3分钟后，将样品在16°C下以000，15×g离心4分钟，并通过向上清液中加入异丙醇沉淀RNA
将样品在-80°C孵育过夜，并在10°C下以16，000×g离心4分钟
用70%EtOH洗涤沉淀并重悬于H2O.如前所述进行逆转录和定量实时PCR
«——【 ·对黑色素瘤增殖和迁移的影响· 】——»细胞外基质的广泛沉积和增强的胶原蛋白积累与许多癌症的生长有关[24，25，26]，尽管胶原蛋白对不同类型癌症的影响多种多样
基质成纤维细胞中缺乏MMP14的小鼠显示皮肤纤维化，以及由于胶原蛋白I.积累增加和皮肤僵硬增加导致的黑色素瘤生长减少
然而，目前尚不清楚由于成纤维细胞（组织中细胞外基质的主要生产者）中MMP14缺失而导致的额外细胞外基质改变是否有助于观察到的效果
为了解决这个问题，我们培养了MMP14sf−/−并控制成纤维细胞14天，这是细胞基质沉积所需的时间
如去除细胞后库马斯染色孔所观察到的那样，当细胞缺乏MMP14（图1在尿素提取的基质中，从6至7个独立的成纤维细胞分离株中定量增加，并显示出显着差异（p<0.01），对照和MMP16的值分别为0±2.17和6.0±3.14μg/mLsf−/−成纤维细胞
接种在MMP16上时，三种黑色素瘤细胞系（B0F16，B1F12和HCmel14）的细胞增殖显着减少sf−/−成纤维细胞的去细胞化基质与对照基质和在血清包衣上培养的细胞相比，用作额外的对照
此外，B16F1黑色素瘤细胞在MMP14沉积的基质上的迁移sf−/−和MMP14SF+/+通过菌落生长方法分析24小时的成纤维细胞在MMP14上减少，这些数据表明，来自MMP14的矩阵sf−/−成纤维细胞对黑色素瘤细胞增殖和迁移产生负面影响
«——【 ·MMP14的组成改变sf−/−成纤维细胞ECM· 】——»我们使用无偏的方法鉴定了没有MMP14的成纤维细胞改变的基质分子[12]
为此，如上所述，我们从每种基因型培养了三个独立的原代成纤维细胞群，并收集了沉积的基质和上清液
使用质谱分析基质组成和条件培养基（图2一个;表S1）
在获得的数据中，我们选择了差异表达的细胞外基质蛋白
同时，我们排除了可能是累积“基质”中去细胞化残基的细胞蛋白
然而，只有<>种细胞外基质在成纤维细胞基质中发生显着改变，<>种在条件培养基中发生显着改变
其中，在基质和分泌部分中都是胶原蛋白XIV
胶原蛋白VI和I也有所增加，尽管不显着，仅在分泌部分，胶原蛋白I在MMP14中升高
«——【 ·胶原蛋白XIV抑制促创活动· 】——»胶原蛋白XIV是在富含I.的胶原蛋白组织中发现的原纤维相关胶原蛋白（FACIT），已知可促进纤维组装并限制横向生长[28，29]
纤维化肺含有高胶原I和增强的胶原XIV表达[30，31]，在肝癌中，胶原XIV有助于维持癌症干细胞的自我更新[32]
在人皮肤中，XIV型胶原蛋白存在于表皮下间隙和真皮中，而在成年小鼠皮肤中，在真皮中检测到的胶原蛋白水平较低[29，33]
然而，人们对其在癌症中的功能知之甚少，特别是在黑色素瘤中
为了研究这种胶原蛋白的生物学作用及其在黑色素瘤中的增加，我们使用了各种体外方法
为了分析其在黑色素瘤细胞增殖中的作用，我们用低（1μg/mL）和高（10μg/mL）浓度的胶原蛋白XIV或FCS（阳性对照）和接种黑色素瘤细胞包被组织培养板
24小时后，使用BrdU掺入法分析增殖
当在胶原蛋白XIV上生长时，与浓度无关，与FCS相比，黑色素瘤细胞增殖较低，当将胶原蛋白XIV添加到FCS中时，对照底物上的黑色素瘤细胞生长减少，因此，胶原蛋白XIV不支持增殖，并且在提供给增殖底物时发挥抑制作用
实验进一步强调了这一点，该实验显示，当添加到由对照（WT）成纤维细胞沉积的促增殖基质中时，胶原蛋白XIV抑制黑色素瘤细胞的增殖，其水平与MMP14基质上检测到的水平相当
sf−/−成纤维细胞
这可能有助于解释在MMP14上检测到的黑色素瘤增殖减少sf−/−成纤维细胞基质，富含胶原蛋白I和XIV
«——【 ·胶原蛋白XIV积聚· 】——»B16F1细胞的肿瘤移植实验，将其皮内注射到MMP14的侧腹sf−/−与对照组相比，对照组在没有成纤维细胞-MMP14的情况下显示肿瘤生长减少[14]
转移的数量没有改变，但血液和淋巴管的血管形成减少
而且，MMP14的肿瘤细胞增殖sf−/−与MMP14相比，小鼠减少SF+/+ [14].在MMP14的肿瘤周围组织中SF+/+小鼠，我们检测到与肿瘤并列的富含XIV的胶原蛋白区域，而剩余的基质信号强度较低
相反，在MMP14的肿瘤切片中sf−/−小鼠，胶原蛋白XIV在肿瘤周围区域强烈检测到，并且在真皮中总体上检测到，在黑色素瘤内延伸一些阳性
通过量化肿瘤周围区域的胶原XIV信号强度
«——【 ·胶原蛋白XIV的表达· 】——»我们发现，当成纤维细胞-MMP14被删除时，增加的胶原蛋白I[14]和XIV会对小鼠的黑色素瘤生长产生负面影响
虽然已经描述了胶原蛋白I在黑色素瘤中的表达[34]，但之前没有研究分析胶原蛋白XIV在人类黑色素瘤中的表达
为了研究黑色素瘤中的胶原蛋白XIV，我们对良性痣和黑色素瘤的人体组织样本进行了免疫染色，并进一步研究了MMP14的表达
所用患者队列的特征如表S2所示
痣中的胶原蛋白XIV在整个真皮中强烈表达，并且在黑色素细胞痣巢周围的区域更加强烈和包装（黄色箭头，图7).相比之下，黑色素瘤的肿瘤周围区域显示胶原蛋白XIV的表达较低（白色箭头，图7)
组织中染色强度的定量显示黑色素瘤中胶原蛋白XIV表达降低（图7).与MMP14对胶原XIV加工的直接功能相关，黑色素瘤的肿瘤周围区域显示出MMP14的高表达（s图7）与痣黑色素细胞巢周围的基质区域相比
«——【 ·结论· 】——»总之，我们表明MMP14的成纤维细胞特异性缺失导致肿瘤周围ECM组成的变化，调节黑色素瘤的生长，增强MMP14中胶原蛋白XIV的积累sf−/−成纤维细胞基质不支持细胞增殖和迁移，从而减少黑色素瘤细胞增殖、迁移和对成纤维细胞基质的粘附
此外，我们确定胶原蛋白XIV作为MMP14的底物，表明增强的胶原蛋白XIV与小鼠黑色素瘤生长的减少相关，为了支持胶原蛋白XIV对恶性肿瘤的负面影响，在人类样本中，胶原蛋白XIV在从良性痣转变为浸润性黑色素瘤时降低